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產(chǎn)品詳情
簡(jiǎn)單介紹：
BL21(DE3)
詳情介紹：
感受態(tài)細(xì)胞基本信息
| 出品公司: | NEB |
|---|---|
| 感受態(tài)細(xì)胞名稱: | BL21(DE3) Ultracompetent cells；BL21(DE3) 超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞 |
| 菌種類型: | E.coli |
| 產(chǎn)品規(guī)格: | 10X100 微升 |
| 轉(zhuǎn)化效率: | 大于1X10的9次方 |
| 基因型: |
 |
| 抗性: | 無(wú)抗性 |
| 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化條件: | 42 ℃熱激 |
| 生長(zhǎng)條件: | 37 ℃, 有氧 |
| 用途: | 非毒性蛋白表達(dá)。 |
| 儲(chǔ)存條件: | -70 ℃或者更低溫度保存，避免反復(fù)凍融。 |
感受態(tài)細(xì)胞特點(diǎn)和簡(jiǎn)介
生物風(fēng)生產(chǎn)的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)過(guò)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細(xì)胞，可以用于質(zhì)粒的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可以高達(dá)108 CFU/ug，-70 ℃保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率也不發(fā)生改變。
大腸桿菌BL21(DE3)生長(zhǎng)速度快，表達(dá)量高，是原核細(xì)胞蛋白表達(dá)*基礎(chǔ)的菌株；
蛋白酶Lon和OmpT的缺陷型，能夠有效減少對(duì)目的蛋白的降解；
適合IPTG誘導(dǎo)的T7啟動(dòng)子載體，常用的pET系列載體；
表達(dá)非毒性蛋白，有密碼子偏好性。
大腸桿菌BL21(DE3)生長(zhǎng)速度快，表達(dá)量高，是原核細(xì)胞蛋白表達(dá)*基礎(chǔ)的菌株；
蛋白酶Lon和OmpT的缺陷型，能夠有效減少對(duì)目的蛋白的降解；
適合IPTG誘導(dǎo)的T7啟動(dòng)子載體，常用的pET系列載體；
表達(dá)非毒性蛋白，有密碼子偏好性。
感受態(tài)細(xì)胞制備方法
生物風(fēng)在氯化鈣感受態(tài)細(xì)胞制作方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，采用*新的二價(jià)錳法感受態(tài)細(xì)胞制備方法，制備得到BL21(DE3)超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（Ultracompetent cell）。轉(zhuǎn)化效率是常規(guī)氯化鈣制備法的10倍。
感受態(tài)細(xì)胞操作方法
1. 取BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無(wú)菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中。
注意：一次轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為 50-100μl，可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。應(yīng)注意所用DNA 體積不要超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。以下實(shí)驗(yàn)以100μl BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為例。
2. 向BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的 DNA (100μl 的感受態(tài)細(xì)胞能夠被1 ng 超螺旋質(zhì)粒DNA 所飽和），輕彈混勻，在冰浴中靜置30 分鐘。
3. 將離心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞冷卻2-3分鐘，該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。
注意：此步驟也可將離心管置于室溫進(jìn)行，時(shí)間不需十分準(zhǔn)確，夏季或室溫較高時(shí)，可放置5-8分鐘左右；如果室溫較低，可延長(zhǎng)時(shí)間至8-15分鐘左右。條件允許建議使用 42 ℃ 熱激方法。
4. 向每個(gè)離心管中加入900 μl無(wú)菌的SOC 或LB 培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)45 分鐘（150 rpm），目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。
5. 將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100μl已轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的SOB或者LB 固體瓊脂培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌的彎頭玻棒涂布器或玻璃珠將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。將平板置于室溫直至液體被完全吸收后，倒置平板，37 ℃培養(yǎng)12-16 小時(shí)。
注意：涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)調(diào)整。如轉(zhuǎn)化質(zhì)粒總量較多，可取更少轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉(zhuǎn)化的質(zhì)?？偭枯^少，可取200-300 μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；對(duì)于連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化菌液，可以通過(guò)離心（4000 rpm，2分鐘）后倒掉大部分培養(yǎng)液上清，吹打懸浮菌體后，將其涂布于一個(gè)平板中。
6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少，可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)平板。
感受態(tài)細(xì)胞注意事項(xiàng)
1. BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70 ℃，不可反復(fù)凍融和放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。
2. 進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí)，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)的溫度及無(wú)菌條件的要求進(jìn)行。
3. 為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可以保留部分連接反應(yīng)液，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到*低。
4. 用于轉(zhuǎn)化的連接產(chǎn)物或質(zhì)粒的體積不能超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的15%.
5. 質(zhì)粒超過(guò)7.5 kb后，隨尺寸的增加轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降，質(zhì)粒的尺寸超過(guò)10 kb時(shí)，在大腸桿菌增殖過(guò)程中也可能會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒缺失現(xiàn)象；
6. 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒量在0.1 pg~50 ng間的效果*好，超過(guò)50 ng質(zhì)粒時(shí)，平板上單克隆數(shù)目會(huì)增加，但是轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。
7. 42 ℃熱擊時(shí)間與離心管的厚度、菌液的體積、轉(zhuǎn)入片段的大小直接相關(guān)，一般建議熱擊60-90秒，熱擊時(shí)間不宜超過(guò)90秒，否則轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降很快；